基因敲入（gene knock in）是一种将外源功能基因，整合或替换到基因组特定位点，并在细胞内获得稳定表达的技术。

1、通过针对靶基因设计、构建gRNA和含有突变位点信息的donor DNA，当两者质控合格后，再与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代阳性小鼠；
2、F0代阳性小鼠与野生型鼠进行交配，获得PCR鉴定基因型和测序鉴定随机插入的F1代杂合子小鼠；
3、选择来自同一只F0代小鼠，敲入位点一致的F1代小鼠，达到性成熟后进行同胞交配，可获得F2代小鼠。对获得的F2代小鼠进行PCR及测序鉴定，理论上，F2代小鼠中25%为敲入位点一致的纯合子小鼠，有50%为只有一条染色体敲入的杂合子小鼠，有25%为野生型小鼠。

Cas9构建KI（基因敲入）小鼠模型利用CRISPR/Cas9系统实现精准基因编辑，通过同源定向修复（HDR）机制将外源DNA序列插入目标基因位点。该技术高效、快速、操作简便，广泛应用于功能基因研究和疾病模型构建。然而，由于依赖同源重组，基因敲入效率较低，存在以下限制：

·  同源重组概率低：天然同源重组频率较低，导致敲入效率不高。

·  位点和片段大小影响：敲入位点的选择和外源片段大小会影响成功率。

·  细胞系差异：不同细胞系对HDR的响应不同，影响敲入效果。

·  筛选标记：是否含有筛选标记也会影响最终的敲入效率。

尽管如此，CRISPR/Cas9技术显著提高了KI小鼠模型的构建精度和灵活性，为基因功能研究提供了有力工具。

基因敲入技术可用于各种目的，除了在培养细胞中进行基因敲入外，还包括在动物模型中引入特定的遗传变异来研究其影响，补偿本地基因的丢失或故障，以及创造具有所需性状的转基因生物体。