抗体（antibody，Ab）是机体 B 淋巴细胞受到抗原刺激后所产生的特异性球蛋白，故亦称为免疫球蛋白。

机体初次接触抗原后，激发机体产生的特异性抗体亲和力低、持续时间短；而当同一抗原再次刺激机体后，则能产生高亲和力、高效价、持续时间长的抗体。由于抗体能与相应的抗原发生特异性结合反应，因此特异性抗体是免疫学实验中常用的试剂，不仅对于抗原的分析鉴定和定量检测极为重要，而且广泛应用于临床疾病的诊断、治疗和预防中。

在免疫学检测中应用的主要抗体是多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体常用免疫动物的方法获得，而单克隆抗体则采用杂交瘤技术制备。

优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，动物的应答能力以及免疫程序（如免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因素）。因此制备高质量的抗体必须具备理想的免疫原、适宜的动物和切实可行的免疫方案。

（一）免疫动物的选择

免疫用的动物主要为哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、豚鼠及小鼠等。选择动物要依据抗体制备的条件而定。

1．抗原与动物的种系： 抗原的来源与免疫动物之间种系关系越远，其抗原免疫原性越强，越易产生免疫应答；反之，种系关系越近，则抗原免疫原性越弱。如用鸡球蛋白免疫亲缘关系较近的鸭或鹅，则免疫原性较差。

2．动物的个体状况： 动物的年龄与健康状况可影响产生抗体的效价，年龄太小者易产生免疫耐受，而年老体衰者免疫应答能力低下，不易产生高效价的抗体。所以用于制备抗血清的动物必须是适龄、健壮、体重合乎一定要求的健康动物。免疫过程中应特别注意营养和卫生管理。

3．抗体的用量和要求 动物的选择常根据抗体的用途和量来决定。制备量大的抗体常选择羊、马等大动物；如所需抗体的量少，宜用小动物，如家兔、豚鼠等。对蛋白质抗原大部分动物均适合，常用家兔和山羊。制备供补体试验用的抗体可选择豚鼠。

（二）免疫方案

不同的抗原，其免疫原性的强弱不一，这取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。在免疫动物时应考虑免疫原的剂量、免疫途径、次数和免疫间隔时间等因素对免疫效果的影响。

1．免疫原的剂量： 抗原的免疫剂量依照给予抗原的种类、注射途径、免疫次数以及受体动物的种类、免疫周期及所要求的抗体特性等而不同。免疫原剂量过大或过小都易引起免疫耐受。在中间剂量范围内，免疫原剂量适当加大，时间间隔延长，可产生较高效价的抗体。一般而言，小鼠首次免疫剂量为每次 50～400μg，大鼠为每次 100μg～1mg，兔为每次 200μg～1mg。加强免疫剂量为首次剂量的 1/5～2/5。如要制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免疫法；如欲获得高效价的抗血清，则宜采用大剂量抗原长程免疫法。

2．免疫途径、次数和间隔时间： 常根据抗原性质、免疫原性及动物的免疫反应性决定免疫途径、免疫次数和间隔时间等。抗原注射途径可根据不同抗原及实验要求，选用皮内、皮下、肌肉、腹腔、静脉或淋巴结等不同途径进行免疫。一般多采用动物的背部、足掌、淋巴结周围、耳后等处皮内或皮下多点注射。两次免疫注射的间隔时间应长短适宜，太短起不到再次反应的效果，太长则失去了前一次激发的敏感作用。一般第一次和第二次间隔 10～20d，3 次及以后间隔7～10d，加佐剂者应为 2 周左右。免疫的总次数一般为 5～8 次。

3．佐剂的应用： 佐剂可增强抗原的免疫原性，使无或弱免疫原性的物质变成有效免疫原。如用可溶性蛋白质抗原免疫家兔，在加用佐剂时一次注入剂量一般为 0.5mg/kg，如不加佐剂，则抗原剂量应加大 10～20 倍。动物实验中最常使用的佐剂为弗氏不完全佐剂（Freund incompleteadjuvant，FIA）和弗氏完全佐剂（Freund complete adjuvant，FCA），前者是将抗原和油剂（液状石蜡或花生油）混合，再加入乳化剂（羊毛脂或吐温 −80），使之成为油包水乳剂。在弗氏不完全佐剂中加入死的分枝杆菌即为弗氏完全佐剂。初次免疫时，最好用弗氏完全佐剂，以刺激机体产生较强的免疫反应。再次免疫时，则采用弗氏不完全佐剂。对可溶性抗原常需加用佐剂，以增强抗原的免疫原性，刺激机体产生较强的免疫应答。

（三）免疫血清效价的鉴定

测定免疫血清效价是及时掌握对免疫动物采血时机的重要步骤，又称试血。

1．颗粒性抗原相应抗体效价的测定 如细菌性抗原多用凝集反应测定，细胞性抗原可用补体依赖的细胞毒实验等方法测定相应的抗体。

2．可溶性抗原相应抗体效价的测定 多采用沉淀反应及简便快速的方法如酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），更为灵敏的放射免疫测定法进行测定。

（四）采血及分离血清

无论是免疫的大动物还是小动物，采血方法均可分为一次放血法和多次放血法两种。

一次放血法，家兔等大动物可用颈动脉放血，豚鼠等小动物可通过心脏直接采血。多次少量放血法，大动物如家兔可通过耳静脉采血，小动物如豚鼠可经耳静脉采血，小鼠可经眶静脉或尾静脉采血。采血后分离血清，可将血液放置于 37℃下 30～60min 使之凝固，血凝块与采集器表面分开，置于 4℃下过夜，使血凝块收缩，离心，移出血清，置于 56℃下水浴 30min 灭活补体。

（五）免疫血清的纯化

更加精细的免疫试验需要从抗血清中提取免疫球蛋白，此过程称为抗血清的纯化。

纯化的步骤为：50% 饱和硫酸铵盐析出沉淀血清球蛋白，应用透析或分子筛法除盐。除盐后的球蛋白过阴离子交换柱（DEAE- 纤维素），根据不同类别免疫球蛋白的等电点，选用不同 pH 和离子强度的缓冲液分别洗脱之；高渗或风干法浓缩免疫球蛋白，若使用冷冻干燥器则可获得干燥制品。

（六）免疫血清性质的鉴定

获得的免疫血清需要进行特异性检测、亲和力测定和效价滴定。

针对颗粒性抗原的免疫血清效价，可通过凝集或溶细胞试验（如溶血素效价滴定）检测。

可溶性抗原相应抗体的效价和纯度多选用环状沉淀、琼脂扩散和免疫电泳的方法检测。

酶免疫测定、放射免疫分析及平衡透析等方法，可用于抗体的特异性和亲和力测定。

（七）免疫血清的保存

1．冰冻保存：冰冻之前先用干冰急速冷冻，然后放 −70～−20℃冰冻。该法保存期较长，可达 2～3 年，在保存期间尽量避免反复冻融，否则可使抗体变性，效价降低甚至完全失效，宜分小包装，是较常用的保存免疫血清的方法。

2．冷冻干燥保存：此为较好的保存方法。将免疫血清干燥成粉分装于安瓿瓶中，急速低温冷冻干燥，火焰封口，置 −20℃可保存 4～5 年。

3．加入防腐剂保存 免疫血清中加入防腐剂后可放 4℃保存，在 1～2 年内使用。常用的防腐剂有叠氮钠、硫柳汞和石炭酸，其应用终浓度分别是 0.01%、0.01% 和 0.5%。但标记荧光的抗体不能用叠氮钠防腐，因其对荧光素有淬灭作用。

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